Все о хитозане – чем нам интересно производное хитина
Хитозан – вещество, о котором все больше и больше говорят в последнее время. Однако FDA пока что не внесла его в список медицинских препаратов, разрешив только как биодобавку, а в справочных материалах медицинской базы данных PubMed он фигурирует всего лишь как одно из средств для снижения веса, причем с сомнительным эффектом:
«Хитозан. Связывает пищевой жир в пищеварительном тракте. Небольшие клинические испытания, в основном низкого методологического качества. Результаты исследований: Минимальное влияние на массу тела. Сообщалось о нескольких проблемах безопасности при приеме 0,24–15 г/день на срок до 6 месяцев; может вызвать аллергические реакции. Сообщаемые побочные эффекты: Метеоризм, вздутие живота, запор, расстройство желудка, тошнота и изжога»1.
Вместе с тем, это вещество широко представлено в виде БАДов, где ему приписываются самые разнообразные полезные свойства: от сорбционной активности до противовоспалительного эффекта. Последний системный обзор, опубликованный в 2021 году, позволяет определиться, что из распиаренных свойств хитозана правда, а что ложь2.
В текущей статье мы, на основании данных этого обзора, поговорим о том, что же такое, собственно, хитозан и почему он так интересен медикам, а в следующих – коснемся его лекарственного применения более подробно.
Из панциря краба. И не только
Начнем с самого главного: хитозан – это не один полимер с определенной структурой, а семейство молекул, различающихся по составу, размеру и распределению мономеров. Эти свойства оказывают фундаментальное влияние на биологические и технологические характеристики полимера. Кроме того, некоторые из заявленных биологических свойств дискретны.
Хитозан является деацетилированным производным хитина. Оба вещества – линейные полисахариды, состоящие из различных количеств связанных остатков N-ацетил-2-амино-2-дезокси-D-глюкозы (глюкозамин, GlcN) и остатков 2-амино-2-дезокси-D-глюкозы (N-ацетилглюкозамин, GlcNAc). Хитозан при этом растворим в водной кислой среде за счет протонирования первичного амина. Напротив, в хитине количество ацетилированных остатков достаточно велико, чтобы предотвратить растворение полимера в водной кислой среде.
Хитин является очень распространенным в природе биополимером, который можно найти в экзоскелете ракообразных, кутикуле насекомых, водорослях и в клеточной стенке грибов. Хитозан встречается в природе реже, у некоторых грибов (Mucoraceae).
Исторически так сложилось, что на продажу хитозан в основном производился путем химического деацетилирования хитина, полученного из ракообразных, поэтому много людей до сих пор уверены, что хитозан находится в панцирях крабов.
Сейчас на рынок под влиянием давления веганов, которые не хотят употреблять животную пищу даже в таком условном виде, начал попадать и другой хитозан, полученный из грибов. Этот вид хитозана проще контролировать по вязкости, кроме того, он имеет очень высокую степень деацетилирования.
Основные заявленные свойства хитозана, из-за которых к нему проявляется такой большой интерес, это:
- Мукоадгезивное.
- Противовоспалительное.
- Антиоксидантное.
- Антимикробное.
- Противогрибковое.
- Антигипергликемическое.
- Противоопухолевое.
- Ранозаживляющее.
- Технические (например, очистка воды).
Интересно, что эти свойства тесно связаны с физико-химическими свойствами полимеров (главным образом с молекулярной массой и степенью ацетилирования). Поэтому при работе с хитином и хитозаном обязательна качественная и полная характеристика полимера.
Основные свойства хитина и хитозана
Хитозан является единственным поликатионом в природе, плотность его заряда зависит от степени ацетилирования и рН среды. Растворимость же зависит от степени ацетилирования и молекулярной массы. Олигомеры хитозана растворимы в широком диапазоне рН, от кислых до основных (в том числе, до физиологического рН 7,4). В то же время, варианты хитозана, молекулярная масса которых высока, растворимы только в кислых водных средах даже при высоких степенях деацетилирования. Это отсутствие растворимости при нейтральном и щелочном рН препятствует использованию хитозана в некоторых случаях в условиях нейтральных физиологических сред, и именно поэтому производство хитозана в основном направлено на синтез вариантов этого вещества с повышенной растворимостью.
Хитозан получают путем деацетилирования хитина, в результате чего некоторые части N-ацетилглюкозамина превращаются в единицы глюкозамина. Наличие большого количества протонированных -NH2-групп в структуре хитозана обусловливает его растворимость в кислых водных средах. Когда около 50% всех аминогрупп протонированы, хитозан становится растворимым.
Помимо молекулярной массы и степени ацетилирования, растворимость хитозана зависит и от ряда других факторов, в том числе от рН, температуры и кристалличности полимера. Так, гомогенное деацетилирование (щелочная обработка, 0 °С) хитина, которое увеличивает количество глюкозаминовых звеньев и приводит к модификации кристаллической структуры полимера, позволяет получать растворимые в водно-уксусных растворах соединения, чего никогда не удается достичь при гетерогенном деацетилировании (щелочная обработка, высокие температуры). При степени деацетилирования 49 % вещество становится растворимо и в воде.
Использование разрушителей водородных связей, таких как мочевина или гидрохлорид гуанидина, также изменяет окно растворимости хитозана. Фактически, за счет сочетания химического и физического разрушения водородных связей достигается широкая растворимость.
Интересным техническим свойством хитозана является и его вязкость. Обусловлено это тем, что очень вязкие растворы трудно поддаются обработке. Кроме того, измерение вязкости позволяет просто и быстро определить молекулярную массу хитозана.
Этот параметр зависит от молекулярной массы полимера и степени деацетилирования и уменьшается по мере уменьшения молекулярной массы вещества. Фактически, вязкость можно использовать для определения стабильности полимера в растворе, так как при хранении полимера наблюдается ее снижение из-за деградации. Также вязкость растет одновременно со степенью деацетилирования хитозана. Этот феномен объясняется химической природой хитозана (полимер является катионным полиэлектролитом из-за протонирования амина в кислой среде): чем выше степень деацетилирования, тем большее расширение цепи ожидается, поскольку в полимерной цепи находится больше звеньев глюкозамина, что приводит к большей плотности заряда в этом образце.
Хитозан вступает во множественные химические реакции благодаря первичной аминогруппе (С2), а также первичным и вторичным гидроксильным группам (С6, С3). Гликозидные связи и ацетамидная группа также могут считаться функциональными группами. Эти функциональные группы позволяют проводить большое количество модификаций, создавая полимеры с новыми свойствами (в первую очередь – растворимость и способность к биологическому разложению) и поведением.
Так, например, растворимость в водной среде улучшается путем деацетилирования, деполимеризации или кватернизации. Что же касается приобретения новых свойств после модификации, то 6-O-сульфатированный хитозан способствует дифференцировке нейронов, а фосфорилированный хитозан ингибирует коррозию.
Основными методами модификации на данное время являются фосфорилирование и деградация хитозана.
Модификации хитозана
Фосфорилирование хитозана происходит довольно просто: хитозан и фосфорная кислота смешиваются в одинаковом соотношении, после чего при 70 °C добавляется формальдегид.
Этот N-метиленфосфоновый хитозан растворим в воде и сохраняет пленкообразующие свойства исходного хитозана. По аналогичной методике получен и растворимый в воде N-метиленфенилфосфоновый хитозан. Кроме того, путем N-алкилирования N-метиленфосфонового хитозана получен и N-лаурил-N-метиленфосфоновый хитозан, который имеет более низкую растворимость в водной среде по сравнению с N-метиленфосфоновым хитозаном, но лучшую растворимость в органических средах и образует мицеллы.
Еще одно интересное соединение хитозана получают при взаимодействии N-метиленфосфонового хитозана и глиоксиловой кислоты. N-метиленфосфоновый N-метиленкарбоновый хитозан водорастворим, сохраняет пленкообразующие свойства исходного хитозана и имеет мультидентатные лиганды, из-за чего ученые планируют использовать его в качестве хелатирующего агента двухвалентных металлов (этим путем, например, получаются формы препаратов, менее раздражающие желудок).
Фосфорилированный хитозан пытаются также применить и как носитель гена, хотя пока что не особо успешно.
Благодаря наличию расщепляемых гликозидных связей возможна деструкция хитозана, что приводит к снижению его молекулярной массы и позволяет, таким образом, контролировать некоторые свойства, например растворимость или вязкость.
Деградация хитозана может происходить с помощью различных механизмов: кислотный гидролиз, окислительно-восстановительная деполимеризация или деполимеризация азотистой кислотой, ультразвуковая деструкция или ферментативная деструкция с использованием специфических и неспецифических ферментов. Хитозан имеет четыре типа гликозидных связей -D-D-, -A-A-, -A-D- и -D-A- (где A и D обозначают мономеры N-ацетилглюкозамина и глюкозамина соответственно). В зависимости от процесса преобладает разрыв определенных связей, и поэтому из одного и того же исходного хитозана могут быть получены разные образцы путем выбора разных методологий.
Считается, что ферментативные методы деградации более избирательны, чем химические и физические, но в целом эффективны и они.
Специфическое ферментативное расщепление хитозана происходит с помощью семейства ферментов, называемых хитозаназами и хитиназами.
Хитозаназы представляют собой гликозилгидролазы, катализирующие эндогидролиз β-1,4-гликозидных связей частично ацетилированного хитозана с высвобождением олигосахаридов хитозана с небольшим высвобождением мономера. Хитозаназа специфически гидролизует хитозан путем расщепления гликозидных связей по схеме -DD·DA- или по схеме -DD·DD.
Хитиназы представляют собой гликозилгидролазы, которые могут расщеплять связи как A-A, так и AD и не проявляют активности против связей DD. Хитиназы можно разделить на две основные категории (эндохитиназы и экзохитиназы) в соответствии с их механизмом действия.
Также хитозан расщепляют и ферменты с неизбирательным действием. В первую очередь это протеазы, липазы, целлюлазы и гемицеллюлазы.
Самым известным из этой группы ферментов является лизоцим, одна из протеаз. Он гидролизует хитозан путем расщепления гликозидных связей с A-A-A-A-типом или A-A-A-D-типом, в то время как A-D-A-тип или D-D-A-A-тип не гидролизуются или гидролизуются очень медленно. Похожими свойствами обладают и другие протеолитические ферменты (пепсин, папаин и проназа).
Нейтральная протеаза расщепляет хитозан в зависимости от степени деацетилирования. Гемицеллюлаза, фермент, который разлагает гемицеллюлозу, доказала свою способность снижать молекулярную массу хитозана способом, который зависит от степени деацетилирования хитозана, создавая образцы с более низкой молекулярной массой. При этом при деградации, видимо, не образуется N-ацетилглюкозамин.
Липазы также доказали свою способность гидролизовать хитозан, хотя скорость деградации при распаде с их помощью ниже, чем при использовании других ферментов. Они могут действовать как путем экзо-, так и путем эндорасщепления (последнее происходит на начальной стадии гидролиза), поэтому контролируя время реакции, можно контролировать получение тех или иных продуктов деградации в результате. Также в случае липазы важен ее вариант: липаза из зародышей пшеницы давала образцы с очень большим разбросом молекулярной массы, тогда как липаза из R. japonicus лучше контролировала полидисперсность.
В следующей статье мы поговорим о том, как химическая форма хитозана влияет на его лечебные свойства.
